免疫反応を利用した各種解析技術と機器（６／７page）

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免疫反応を利用した各種解析技術と機器（６／７page）

TOPIX
● 免疫反応解析で用いられる実験手法
   （サンドイッチ法｜競合法（直接競合ELISA）｜直接吸着法（間接競合ELISA））
● 免疫反応解析に利用される機器
   ◆ プレートリーダー（吸光プレートリーダー｜発光プレートリーダー｜蛍光プレートリーダー）
   ◆ マイクロビーズアッセイシステム
● 発色を利用して検出する試薬｜発光を利用して検出する試薬｜蛍光を利用して検出する試薬
● 実験における注意点（プレートウォッシャー）
● 受託サービス

●試薬と消耗品

EIAに使用する試薬には大きく分けて抗体と酵素・基質が、消耗品としてマイクロプレート・マイクロストリップがあげられます。抗体に関しては抗原の数だけ存在するので、実験内容によって非常に多くの種類があり、酵素・基質に関しても用途別にいくつかに分類されていますのでその組合せは無数にあるといっても良いでしょう。

今回はこれら数多くの試薬を、検出するシグナルの種類によって分類していきます。

◆発色を利用して検出する試薬

最も一般的に使用されている試薬です。酵素反応により特定の色を呈するよう設計されています。酵素・試薬の組合せが多種にわたり、また反応自体も簡便で、極端な場合では目視で反応状況が判別できるのもメリットの一つであります。検出は吸光プレートリーダーによる吸光度の測定で行われます。

◆発光を利用して検出する試薬

一部で採用されているのが、発光反応を利用した試薬です。発色試薬と比べてより高感度・検出限界が高い点が特徴になります。逆に目視では反応状況は判別できず、検出には発光を測定できる機器を使用します。

◆蛍光を利用して検出する試薬

発色試薬と同様に、一部の試薬で採用されています。発色試薬と比べて高感度・検出限界が高い点も、発光試薬と同様です。しかし蛍光試薬は特殊な励起光が必要なので、試薬にあった機器・フィルターが必要になります。

各試薬のメリットとデメリット
試薬	メリット	デメリット
発色試薬	バリエーションが豊富目視での確認が可能	検出階調は普通
発光試薬	高感度	試薬の扱いに注意が必要
蛍光試薬	高感度	試薬の扱いに注意が必要

◆EIA専用消耗品

ELISAでは、抗体や標的物質を直接容器に吸着させ、プレートごと解析します。そのため、プレート表面に対する各種試薬の吸着率、検出光の透過性が実験結果に大きく影響します。

●実験に関する注意点

EIAには様々な方法があり、それぞれに特有のメリット・デメリットがあることはおわかりいただけたと思います。しかし、メリットを十分に発揮するためには、他の実験手法でも同様ですがいくつかの注意点があります。

まず、本法は酵素や抗原・抗体反応などタンパク質を利用した実験法なので、反応速度は温度条件に強く影響されるということです。実験環境は常に一定にしないと、大きく誤差が生じてしまうので気をつけなくてはなりません。

次に、殆どの実験系であらかじめ基準値（コントロール）を測定しなくてはならない点です。この時のコントロールの精度、コントロールとして測定する標的物質の濃度がずれていると、正確なデータ取得が出来なくなる点です。あらかじめ測定したいサンプルのデータを推測し、それを用いてその都度コントロールを調節する必要があります。

最後に、酵素反応を阻害・変化させる物質のコンタミネーションを防ぐということです。酵素反応に影響を与える物質は化学物質のみならず、人体から出る汗・唾液などにも含まれています。全ての実験において共通ですが、最もコンタミネーションの頻度が高いのは実験者の実験操作に因るものです。実験中の実験操作にはくれぐれも気をつけましょう。

EIA実験に関する注意点と対処法
EIA実験に関する注意点	考えられる対処法
温度管理の徹底	研究室環境の均一化（空調による室内温度管理）試薬類の温度管理（使用する前のインキュベーションなど）
適切なコントロールの作製	実験条件が変わるごとにコントロールを取得する他手法を用いて標的物質の定量を行う
コンタミネーションの予防	実験器具を専用にして、他実験との共用を避けるマスク・グローブ・クリーンベンチの使用余裕を持った実験計画の作成

高い特異性を持つEIAにおいても実験操作によってデータにばらつきが発生することもあります。
特に、試薬類の洗浄はEIAにとって重要な操作で、この操作の均一性・スピードがデータに大きく影響を与えることが広く知られています。もちろん手作業で正確なデータ取得を出来る場合もありますが、大量のサンプルを扱う場合などには機械を用いた方が早く・正確にそして均一に処理することが出来ます。

次はこれらの操作を行う機器を紹介していきます。

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