免疫反応を利用した各種解析技術と機器（２／７page）

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免疫反応を利用した各種解析技術と機器（２／７page）

TOPIX
● 免疫反応解析で用いられる実験手法
   （サンドイッチ法｜競合法（直接競合ELISA）｜直接吸着法（間接競合ELISA））
● 免疫反応解析に利用される機器
   ◆ プレートリーダー（吸光プレートリーダー｜発光プレートリーダー｜蛍光プレートリーダー）
   ◆ マイクロビーズアッセイシステム
● 発色を利用して検出する試薬｜発光を利用して検出する試薬｜蛍光を利用して検出する試薬
● 実験における注意点（プレートウォッシャー）
● 受託サービス

◆サンドイッチ法

サンドイッチ法は、標的物質に対する抗体（１次抗体）をマイクロプレートなどに吸着させ、抗体に結合した標的物質に対してさらに酵素標識した抗体（２次抗体）を結合させるという手法です（図２）。

マイクロプレートなどの表面に１次抗体を結合させておき、そこへ測定したい抗原を含む溶液を注入し抗原抗体反応をさせます。十分に反応させた後、標識済みの２次抗体を注入し抗原と結合させます。遊離状態の抗体を除去したあと、酵素標識の場合はその酵素の発色・発光基質を、蛍光標識の場合は保護バッファーを混ぜ、プレートリーダーでシグナルを観察します。

サンドイッチ法は、標的物質に結合する２次抗体の比を１：１から数倍にまで上げることが出来るので、微量物質を高感度で検出することが出来ます。

また、全ての標的物質と吸着できるよう過剰量の１次抗体が用いられているので、標的物質の取りこぼしがないということもメリットのひとつです。しかし、サンドイッチ法では抗原に対する１次抗体と２次抗体のエピトープを変える必要があり、それぞれの抗体はお互いを抗原と認識しないよう、抗体設計する必要があります。

サンドイッチ法のメリットとデメリット
メリット	デメリット
シグナルの増幅が容易	抗体の種類を変える必要がある
確実に標的を検出できる	－

これらの特徴から、サンドイッチ法は、標的物質の検出に２つの抗体を用いることから、高い検出精度を要求する場合に有効な方法です。

◆競合法（直接競合ELISA）

競合法では、先に説明したサンドイッチ法とともに標的物質に対する抗体（１次抗体）をあらかじめマイクロプレートなどに吸着させ、次に標的物質とともに、酵素標識した競合物質を反応させます（図３）。

サンドイッチ法と同様に、マイクロプレートなどの底面に１次抗体を結合させます。次に抗原と標識した抗原（競合物質）の混合液を注入し、十分反応させます。遊離状態の抗原・競合物質を除去した後、酵素標識の場合はその酵素の発色・発光基質を、蛍光標識の場合は保護バッファーを混ぜ、プレートリーダーでシグナルを観察します。

競合法は、増幅を行わない場合は１次抗体のみ用意すればよく、またインキュベーション反応も１ステップで終わるので、簡単でスピーディーにデータを取得することが出来ます。また、標的物質の量は結合した競合物質量の逆数で換算するため、極微量のサンプルなど、通常ではシグナルを検出しにくい実験でも検出することが出来ます。

しかし、標的物質の濃度があまりにも基準値と異なる場合、用いる抗体量が足りないもしくは大過剰となり、正確な測定が難しくなります。

競合法（直接競合ELISA法）のメリット・デメリット
メリット	デメリット
微量サンプルでも検出できる	標的物質の濃度を推定する必要がある

これらの特徴から、競合法は極微量のサンプルで、なおかつあらかじめその濃度が推定出来る場合に有効な方法だと言えます。

◆直接吸着法（間接競合ELISA）

主にキットを用いず自作でELISAを行うときによく使われる方法です。上２つの実験法では、１次抗体をマイクロプレートに吸着させていましたが、直接吸着法では直接、標的物質をマイクロプレートに吸着させます。

次に、標的物質が結合したプレートを洗浄し、他の物質がプレートに吸着しないようブロックさせます。このプレートに、標的物質に対する１次抗体を反応させ、さらに１次抗体に対する標識済み抗体（２次抗体）を反応させます（図４）。

直接吸着法では、マイクロプレートなどの底面に直接測定したい抗原を結合させます。十分に抗原が結合した後、抗原が結合していないプレート表面をブロッキング剤で保護し、他のタンパク質が吸着しないようにします。そのプレートに対して１次抗体を反応させ、さらに１次抗体に対する標識２次抗体を反応させます。

本法では専用マイクロプレートなどを用意しなくても自作できる点がメリットです。しかし、最初に行う標的物質の吸着の際、溶液中の不純物が吸着することもあり、不純物が優先的に吸着した場合には正確な検出ができないこともあります。

直接吸着法（間接競合ELISA法）のメリット・デメリット
メリット	デメリット
自作するのが容易である	サンプルを十分精製する必要がある

これらの特徴から、直接吸着法はサンプル溶液中の夾雑物が少なく（もしくは標的物質の精製が容易であり）、キット化製品を使わない場合に有効な方法だと言えます。

それでは、これらの手法を利用した機器を見ていきましょう。

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