発現解析を発展させる技術！（リアルタイムPCR編）（２／４）

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発現解析を発展させる技術！（リアルタイムPCR編）（２／４ page）

リアルタイムPCRのTOPIX
・リアルタイムPCRの原理（インターカレーター法・蛍光プローブ・サイクリングプローブ法）
・リアルタイムPCRのアプリケーション
・機器選定のポイント
・温度コントロールに空冷方式を採用する機器 / 冷却系にペルチェ素子を採用する機器
・関連受託サービス（プローブ作製・リアルタイムPCR解析受託）

SYBR green Iは２本鎖DNAにインターカレートし、DNAと結合した分子のみが励起光で励起される特徴を持つ。そのため、PCR反応で合成された２本鎖DNAを検出することが出来る。ただし、SYBR green IのDNA結合は配列非特異的反応のため、プライマーダイマーや非特異的増幅産物にも結合し、シグナルを発することがある。

インターカレーター法は、２本鎖DNAに結合する色素（主にSYBR Green I）をPCR反応液に混ぜ、ポリメラーゼによって合成された2本鎖DNAを検出する方法です。（図２）

インターカレーター法では、『遺伝子ごとに専用プローブが必要なく、実験コスト、プローブ構築の手間が省ける』のがメリットになります。

反面、蛍光色素は2本鎖DNA全てを検出するため、プライマーダイマーやミスプライミングによる増幅産物も同時に検出してしまいます。

そのため、検出特異性はこの後に紹介する蛍光プローブ法に劣ります。また、複数遺伝子を同時に解析するマルチカラー解析は出来ません。

精密解析前のファーストスクリーニングや、
単一遺伝子に対する大規模解析を行う上で、１サンプルあたりのコストを低く抑えたい時
などに有効な方法です。

また、１次スクリーニングや大規模解析に用いられるこのアプリケーションを行う上で機器に求められる性能として、大量のサンプルを解析できるスループット性とそれを処理できる速度が求められます。

インターカレーター法に使用する試薬は、
ロシュ・ダイアグノスティックス、キアゲン、日本ジェネティクス、日本バイオ・ラッドラボラトリーズ、タカラバイオ
コスモ・バイオ、アプライドバイオシステムズ、和光純薬、シグマアルドリッチ、エアブラウン、インビトロジェン

【順不同/（株）は略】

などから販売されています。

蛍光プローブ法は、目的遺伝子の増幅を、その遺伝子特異的なプローブが増幅に使用されたか否かを測定することで検出する方法です。蛍光プローブ法には多くの種類がありますが、ここでは代表的な例として、TaqMan^TMプローブ法と、サイクリングプローブ法を紹介したいと思います。

TaqMan^TMプローブ法（図３）は、5’末端を蛍光色素、3’末端をクエンチャー物質（消光物質）で修飾した目的遺伝子特異的なプローブを用いる方法で、ポリメラーゼによってPCR反応が進むことによりクエンチャーが蛍光色素と離れ、蛍光を発します。（図４）

蛍光プローブ法には蛍光色素、クエンチャーの種類によって様々なタイプがあり、中にはクエンチャーを含まない（プローブ配列の工夫によりクエンチャー様の働きをする）特殊なプローブや、クエンチャーの代わりにFRET原理を用いたものあります。

検出したい遺伝子の一部分(プライマーではない)と相補的な配列の上流と下流に、それぞれ蛍光色素とクエンチャーと呼ばれる消光物質を結合させている。通常、蛍光色素とクエンチャーが近傍にある(TaqManTMプローブがPCR反応に使用されていない)状態では、蛍光色素に励起光があたってもクエンチャーの働きにより強い蛍光を発することがない。

TaqMan^TMプローブは目的遺伝子内の特異的配列と結合し、伸長反応の過程でDNA polymeraseの5’-3’Exonuclease活性によって分解されていきます。そのとき、蛍光色素とクエンチャーが離れるので、蛍光を検出することが出来ます。プローブは目的遺伝子以外には結合しないよう設計するので、ミスプライミングによる非特異的増幅産物は検出されません。

どの種類でも蛍光プローブ法は、目的遺伝子特異的なプローブを使用することもあり、極めて高い検出特異性を誇ります。しかし、個々の遺伝子に対して専用設計のプローブが必要なため、１サンプルあたりのコストは高くなります。

ターゲット絞った精密解析や、
複数のプローブを用いたマルチカラー解析を行う場合に
有効な方法となります。

このアプリケーションを行う上で必要な機器性能として、クエンチャーが離れたらすぐに蛍光を検出できるような高い検出感度があげられます。

蛍光プローブ法に使用する試薬は、
ロシュ・ダイアグノスティックス、キアゲン、アプライドバイオシステムズ、和光純薬、シグマアルドリッチ
インビトロジェン

【順不同/（株）は略】

などから販売されています。

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